上月，Ionis公司宣布其抗治疗家族性淀粉样多发性神经病变（FAP）的反义核酸药物Inotersen三期临床试验达到主要疗效终点，Alnylam公司CEO在季报中暗示其首个RNA干扰药物Patisiran有希望在一年内上市，独角兽Moderna公司公布了其mRNA药物平台首个候选疫苗药物的人体概念验证结果，显示出非常高的血清转化率，此外更不用提堪称上帝的手术刀的基因编辑技术，一直都是在霸屏。

 

为了近距离观察如今大热的核酸药物开发，从反义核酸到基因编辑，本文梳理了四种技术的作用机制和各派技术的领头公司。

 

反义核酸技术

 

反义核酸（ASO）是一段单链的DNA或RNA序列，通常包含十几个到几十个碱基，作用的对象是mRNA，也即是通过调控mRNA来调控基因表达。ASO调控基因表达的途径有三种：第一种是，ASO与mRNA结合后，牢牢的抓住mRNA，形成空间位阻，使mRNA不能再进入核糖体进行蛋白质翻译，使得这种mRNA所携带的基因信息表达下调（下图中A）。第二种是ASO通过碱基互补配对，与靶标mRNA结合后，招募RNA酶H将mRNA降解，同样使得基因表达下调（下图中B）。第三种途径比较特殊，这种应用的背景是，有些pre-mRNA在形成mRNA的过程中，部分外显子被错误地剪切，导致得到非正常编码的mRNA，从而最终生成的蛋白质缺乏正常功能（如杜氏肌营养不良症）。这种情况下，ASO结合于Pre-mRNA的某个外显子区域，使得这段外显子被剪切掉，在最后生成的mRNA中不包含这段外显子，而剩下的部分仍能生成一种能够发挥原本功能的蛋白（下图中C）。

 

Future Med. Chem. (2011) 3(3), 339–365

 

去年获批上市的Spinraza和 Exondys 51开发者分属Ionis公司和Sarepta公司，Ionis公司无疑是反义核酸技术的带头大哥，目前Ionis的研发管线中有多达28个反义核酸药物，已经获批或进入临床三期研究的也有7个。Spinraza是继Formivisen和Mipomersen之后Ionis第三个上市的RNA药物，但和前两个药物不同，Spinraza峰值销售有望达到10-20亿美元，成为首个重磅RNA药物，可以说Spinraza开启了核酸药物的元年。

 

 

RNA干扰技术

 

RNA干扰的作用对象同样是mRNA，但其作用机制与反义核酸不同。RNA干扰由双链的siRNA引发，经典的siRNA是在体内由双链RNA（dsRNA）在Dicer酶的剪切作用下形成的具有约21个碱基长度的小RNA分子，用于药物开发的siRNA一般都是体外直接合成后导入细胞中的，可以再经过或不经过Dicer酶的剪切。在细胞内，siRNA与RNA干扰相关的蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RISC)，同时双链被解离成正义链和反义链。反义链与靶基因的mRNA结合，然后在RISC复合体中的Ago蛋白作用下，将mRNA剪切，从而下调基因的表达。可引起RNA干扰过程的除了双链的siRNA外，典型的还有类似结构的miRNA和piRNA等。

 

 

Alnylam是RNA干扰技术药物开发的代表者，自2002年成立以来，一直专注于RNA干扰药物的开发。目前Alnylam有约7项siRNA药物处于临床研究中，其中包括一个三期临床研究的项目Patisiran。Patisiran是一种基于脂质体递送技术的siRNA药物，用于治疗家族性淀粉样多发性神经病变（FAP）。Alnylam公司还有两项有关siRNA药物开发的关键技术，一项是有关siRNA稳定化修饰的ESC技术，一项是高效肝靶向递送技术GalNAc缀合靶向给药技术。这两项技术的结合，使得可以通过皮下注射的方式，高效的递送siRNA药物到肝脏细胞中，并且产生持久的基因抑制效果。

 

RNA干扰技术和反义核酸技术主要途径都是作用于mRNA，抑制靶标基因表达。反义核酸由于起步较早，目前已经上市了几个药物，RNA干扰技术目前正在等待它的首个药物的上市，最有可能的就是Alnylam的Patisiran。尽管如此，目前Alnylam公司的市值要高于Ionis。

 

 

mRNA技术

 

mRNA治疗技术的机制看起来似乎简单直接，如果人体某种蛋白质的产生量不够，或者产生的是不能实现正常功能的蛋白，那么向细胞内输入相应的mRNA，用来编码产生相应的替代蛋白质，就可以治疗相应的疾病。另一方面，也可将病原物或者肿瘤细胞表面的特异性抗原的mRNA递送到患者体内，通过宿主细胞表达出蛋白，诱导宿主对该蛋白产生免疫应答，实现对疾病的预防与治疗。这如同是在病人自己的细胞内制造药物，而不是在实验室制备用于服用或注射的药物。

 

 

 

然而实际的困难是，mRNA是一种不稳定的，难以通过细胞膜的生物大分子，而且，长链的mRNA还会引起人体的免疫反应。而克服这些困难，就要提到一家神一般存在的公司了，成立于2011年的Moderna，经过短短几年发展，公司估值就已经达到了数十亿美元。Moderna的核心技术是mRNA修饰技术，修饰后的mRNA不仅具有足够的稳定性，而且不会触发常见的免疫反应。mRNA的递送采用了已经经过其他核酸药物开发中实践的脂质体递送技术。由此也可看出，mRNA药物相较于基于质粒的核酸治疗药物（通常用病毒载体递送）而言，突出的一项优势是避免了外源导入分子被整合进人体基因组的风险。

 

Moderna公司雄心勃勃地计划在十年内将100种药物投入到临床实验中去，用于治疗几乎所有的疾病类型——从肿瘤到罕见的遗传性疾病。在强大的资金支持下，目前公司已经开展了50多项药物研发项目，多个项目陆续进入一期临床。这些项目通过与其他大型药物公司合作或在自己的四家全资子公司进行，四家子公司分别是Valera（专注于感染性疾病），Onkaido（专注于免疫-肿瘤疾病），Caperna（专注于个性化肿瘤疫苗），Elpidera（专注于罕见病）。而Moderna公司本身，似乎更像一个技术平台公司，专注于mRNA技术本身。

 

 

基因编辑技术

 

 

 

 

 

 

基因编辑是近几年生物技术领域的网红，因为它直接作用于基因的载体--DNA，对DNA进行剪切和修改。对DNA的修改对生命来说是根本性的，因此基因编辑也被比喻为上帝的手术刀。

 

实际上，对基因编辑技术的研究已经很久了。第一代基因编辑技术发明于90年代，叫锌指蛋白核酸酶技术（ZFN），它的机制是一个锌指蛋白模块可以定位连续的三个碱基序列，将一连串合乎要求的锌指蛋白模块连起来，就能准确定位一段DNA碱基序列，从而像GPS在浩如烟海的DNA碱基序列中一样找到目标基因位置，然后ZFN上连接的另一段蛋白FokI将目标位点的DNA链切断，利用细胞内天然存在的DNA修复机制，再重新连接断开的DNA。第二代的基因编辑技术发明于不到10年前，被称作“神话”核酸酶技术（TALEN），“神话”是因为这个蛋白的缩写正好是TALE这个单词。它的机制是一个TALE蛋白模块，可精确定位一个DNA碱基，同样，一连串的TALE蛋白模块连起来，就能准确定位一段DNA碱基序列，然后再用FokI蛋白剪切靶标DNA。TALE蛋白核酸酶对锌指蛋白核酸酶已经是一个飞跃，因为锌指蛋白与DNA碱基序列的适配关系，需要每次通过大量计算和实验来筛选，费时费力。而TALE蛋白完全可以达到精确的匹配性，因此只要按照需要直接确定好TALE蛋白模块的顺序就好了，就像编程一样。真正让基因编辑从科研领域变身大众网红的是第三代技术CRISPR/Cas9。简单来说，在CRISPR/Cas9技术中，用于定位基因碱基序列，起到GPS作用的是一段RNA，它与靶标DNA通过精确的碱基互补配对来确定目标，一个RNA碱基就能定位一个DNA碱基，这极大的降低了基因编辑实验的操作难度。这段起到定位作用的RNA在细胞内与Cas蛋白结合，它们的结合复合物在细胞内“巡逻”，一旦发现一段DNA序列能够与这段RNA完美的结合，就会激活Cas蛋白，定位剪切DNA。

 

第三代的CRISPR/Cas9技术相与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。资本也迅速涌入这个领域，以CRISPR/Cas9技术主要创立者领衔的三家公司Editas Medicine（张峰）、Intellia Therapeutics（Jennifer Doudna）、CRISPR Therapeutics（Emmanuelle Charpentier）如今已经齐聚纳斯达克。更多的公司和机构在利用此项技术开发各种包括疾病治疗方案，进行作物改良等等应用。如今基因编辑技术的商业应用处于群雄并起的时代，但是这个领域的前景也是大到难以想象。相比于反义核酸，RNA干扰和mRNA技术，基因编辑直接作用于DNA，在安全性、伦理等方面还有这样那样的争议。尽快如此，基因编辑技术犹如历史的车轮一样，必定会不断向前发展。

摘自：黄金宇 瑞博小核酸制药